Биомаркеры функциональной способности печени что это

Владельцы патента RU 2505821:

Настоящее изобретение относится к способам диагностики фиброза печени у субъекта, включающим определение уровней экспрессии плазминогена урокиназного типа, матричной металлопротеиназы 9 и β-2-микроглобулина, вычисление на их основании балльной оценки и постановку диагноза. Также настоящее изобретение относится к набору для диагностики фиброза печени, содержащему первое антитело, специфически связанное с активатором плазминогена урокиназного типа (uРА), второе антитело, специфически связанное с матричной металлопротеиназой 9 (ММР9), и третье антитело, специфически связанное с β-2-микроглобулином (β-2-MG). 6 н. и 11 з.п. ф-лы, 33 табл., 3 пр.

Настоящая заявка заявляет приоритет на предварительную заявку США №61/119,077, поданную 2 декабря 2008; ее содержание здесь полностью включено в виде ссылки.

Предпосылки настоящего изобретения

Фиброз печени включает избыточное накопление белков внеклеточной матрицы (например, коллагена) на клетках печени, что приводит к образованию рубцовой ткани. Это происходит при большинстве хронических заболеваний печени, типа метаболических заболеваний печени и заболеваний, связанных с инфекциями гепатита В или С, а также при употреблении алкоголя. Развившийся фиброз печени приводит к циррозу печени, раку печени, печеночной недостаточности и портальной гипертензии.

В настоящее время биопсия печени представляет собой оптимальный способ выявления фиброза печени, а также определения его тяжести. Однако биопсия печени, как инвазивная процедура, не является идеальным способом диагностики.

Для диагностики фиброза печени были разработаны неинвазивные серологические анализы, основанные на ассоциированных с фиброзом сывороточных биомаркерах. Точность и чувствительность таких анализов в сильной степени зависит от используемых биомаркеров. Поэтому чрезвычайно важно выявить надежные биомаркеры, которые с высокой чувствительностью отличают пациентов с фиброзом от людей, не страдающих им.

Краткое содержание настоящего изобретения

Настоящее изобретение основано на неожиданном выявлении трех новых сывороточных биомаркеров, а именно, активатора плазминогена урокиназного типа (uPA), матрицы металлопротеиназы 9 (ММР9; GenBank Accession Number) и β-2-микроглобулина (β-2-MGB) для диагностики фиброза печени.

Таким образом, один аспект настоящего изобретения характеризует способ диагностики фиброза печени на основе уровня экспрессии одного или более из трех упомянутых выше биомаркеров, при необязательном сочетании с одним или более дополнительным сывороточным биомаркером, типа глутаминовой оксалоацетиктрансаминазы (GOT) глутаминовой пировиноградной трансаминазы (GPT) и альфа-фетопротеина (AFP).

Описанный диагностический способ включает по меньшей мере 4 стадии: (i) получение образца крови от субъекта, подозреваемого в фиброзе печени (например, от носителя вируса гепатита В или С, или пациента, страдающего связанным с алкоголем заболеванием печени, или метаболическим заболеванием печени); (ii) определение в полученном образце крови уровня экспрессии одно или более перечисленных ранее биомаркеров; (iii) вычисление балльной оценки заболевания на основе установленного уровня экспрессии; (iv) на основе полученной балльной оценки выявление, имеется ли у указанного пациента фиброз. Этот диагностический способ включает (необязательно) после указанной стадии (iv) дополнительную стадию (v): оценка стадии фиброза у указанного пациента на основе полученной балльной оценки по сравнению с ранее установленными величинами предельной концентрации, определяющими различные стадии фиброза. Используемый здесь термин «диагностика» касается выявления наличия/отсутствия у субъекта (например, у человека) фиброза печени или оценки стадии этого заболевания. Образцом крови может быть любой образец, полученный из крови, типа образца сыворотки или образца плазмы.

Указанную балльную оценку можно определить, если уровень экспрессии биомаркера подвергнуть анализу дискриминантных функций, анализу методом гребневых регрессий или анализу методом логических регрессий.

Другой аспект настоящего изобретения характеризует диагностический набор, содержащий по меньшей мере два антитела (например, целые молекулы иммуноглобулина), причем одно из них специфично по отношению к uPA, MMP9 или β-2MGB, а остальные — специфичны по отношению к uPA, MMP9, β-2MGB, GOT, GPT и AFP. Эти два антигена имеют различную антиген-специфичность. Предпочтительно, чтобы в целях диагностики фиброза печени указанный набор состоял в основном из указанных выше антител, а именно содержал только антитела, специфичные к выявляемому антигену (например, фиброз-ассоциированные биомаркеры). В одном примере указанный набор содержит антитело в отношении uPA, антитело в отношении MMP9 и антитело в отношении β-2MGB.

Объем настоящего изобретения включает также применение любого из упоминаемых выше антител при диагностике фиброза печени или при изготовлении набора для диагностики фиброза печени.

Подробности одного или более вариантов настоящего изобретения приведены ниже в описании. Другие признаки или преимущества настоящего изобретения будут очевидны из приведенного далее подробного описания некоторых вариантов, а также из прилагаемых пунктов формулы изобретения.

Подробное описание настоящего изобретения

По одному своему аспекту настоящее изобретение касается способа диагностики фиброза печени на основании уровня в крови субъекта биомаркеров uPA, MMP9, β-2MGB, их сочетания, или сочетания из (a) одного или более uPA, MMP9 и β-2MGB, и (б) одного или более дополнительных биомаркеров фиброза (например, GOT, GPT и AFP). Этот способ применим к пациенту для выявления у него или ее наличия/отсутствия фиброза печени или для оценки стадии этого заболевания. Указанный пациент может быть носителем вируса гепатита В или вируса гепатита С, или пациентом, страдающим от связанным с алкоголем заболевания, (например, жировая инфильтрация печени, или алкогольный гепатит), метаболическим заболеванием печени или раком печени.

uPA человека имеет две изоформы, обе их можно использовать в способе диагностики по настоящему изобретению. Инвентарный номер изоформы 1 в GenBank NP_002649.1 (18-OCT-2009), а изоформы 2 в GenBank — NP_001138503.1 (18-OCT-2009). Инвентарные номера в GenBank двух других новых маркеров, MMP9 и β-2MGB-NP_004985.2 (18-OCT-2009), (22-NOV-2009) и NP_004039.1 (25-OCT-2009) соответственно.

Для применения способа по настоящему изобретению образец крови может быть получен от субъекта, подозреваемого в фиброзе печени, а уровень одного или более упомянутых выше биомаркеров можно определить стандартным методом, например твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA) или вестерн-блоттингом. Для того, чтобы получить балльные оценки, которые характеризуют профиль крови, данные, указывающие уровень биомаркеров, подвергают анализу дискриминантных функций, анализу методом гребневых регрессий или анализу логических регрессий. Если это необходимо, то в рассмотрение могут быть включены клинические факторы (например возраст и гендерные характеристики пациента). Затем, для того чтобы проанализировать, имеет ли конкретный субъект фиброз печени, и если имеет, то какова его стадия, полученные балльные оценки сравнивают со значением предельной концентрации, определяющей наличие или отсутствие фиброза печени, или с установленными значениями предельной концентрации, которая распознает различные стадии фиброза. Указанные значения предельной концентрации можно определить, исследовав одинаковыми анализами профиль крови одних и тех же биомаркеров у субъектов, не страдающих фиброзом печени, и у пациентов с различными стадиями фиброза. Например, возможно наличие средней точки между балльными оценками для субъектов, не страдающих фиброзом печени, и для пациентов с фиброзом.

Ниже описана примерная методика определения упомянутых выше значений предельной концентрации на основе факторов, которые, как установлено, связаны с различными стадиями фиброза:

(1) отнесение пациентов с фиброзом печени в различные группы, исходя из статуса заболевания (например, стадии фиброза и факторов риска);

(2) выявление у указанных пациентов потенциальных факторов, которые могут коррелировать со стадиями фиброза;

(3) выделение с помощью инвариантного анализа из установленных потенциальных факторов тех факторов, которые существенно различаются для разных групп пациентов;

(4) установленные факторы подвергают анализу методом дискриминантных функций, методом гребневых регрессий логических регрессий, или методом обобщенных линейных моделей для того, чтобы оценить независимое значение каждого из этих факторов в диагностике фиброза;

(5) создание дискриминантной модели, модели гребневых регрессий или модели логических регрессий для того, чтобы на основе установленных факторов (включая ассоциированных с фиброзом биомаркеров, и клинических факторов при условии их применимости) вычислить балльную оценку заболевания; а также

(6) определение предельной концентрации для каждой стадии заболевания на основании полученных балльных оценок (например, средней величины) в каждой группе пациентов, а также других релевантных факторов, типа чувствительности, специфичности, прогностичности положительного результата (PPV) и прогностичности отрицательного результата (NPV).

Диагностическая значимость разработанных дискриминантной модели, модели гребневых регрессий или модели логических регрессий может быть оценена анализом характеристической кривая обнаружения, для создания соответствующей кривой (ROC-характеристика). При таком анализе оптимальная многовариантная модель обеспечивает значительную площадь под указанной кривой (AUC). Эти модели описаны ниже в примерах 1-3.

В описанном выше диагностическом способе используется набор, который также включен в объем настоящего изобретения. Этот набор, содержит одно или более антител, специфичных к фиброз-ассоциированным биомаркерам uPA, MMP9, β-2MGB, а также (необязательно) к другим биомаркерам, представляющим интерес — GOT, GPT и AFP. В одном варианте указанный набор включает два разных антитела (а именно, сенсибилизирующее антитело и распознающее антитело), связывающиеся с одним и тем же биомаркером. Обычно распознающее антитело соединяется с молекулой, испускающей или свой собственный распознаваемый сигнал, или сигнал, распознаваемый благодаря ее связи с другим агентом. Используемый здесь термин «антитело» касается целого иммуноглобулина или его фрагмента, типа Fab или (Fab’)₂. сохраняющего антиген-связывающую активность. Это может встречающееся в природе антитело или антитело, построенное с помощью генной инженерии (например, одноцепочечное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело).

В указанный набор по настоящему изобретению включены антитела, которые можно получить от поставщиков. Или же, антитела могут быть получить стандартными способами. Для того, чтобы продуцировать антитела в отношении определенного указанного выше биомаркера, этот маркер, связанный (необязательно) с белком-носителем, можно смешать с адъювантом и сделать его инъекцию в организм хозяина-животного. Продуцированные этим животным антитела очищают аффинной хроматографией. Стандартно используемыми хозяевами-животными являются кролики, крысы, морские свинки и мыши. Для усиления иммунного ответа могут быть использованы различные адъюванты, это зависит от вида животного. В число таких адъювантов входят: адъювант Фрейда (полный или неполный, минеральные гели (типа гидроксида алюминия), поверхностно-активные вещества (типа лизолецитина), полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол. В сыворотке иммунизованных животных присутствуют поликлональные антитела, а именно гетерогенные популяции молекул антител.

Моноклональные антитела, а именно гомогенные популяции молекул антител можно получить, используя стандартную методику гибридом (смотри, например Kohler et al. (1975) Nature, 256, 495; Kohler et al. (1976). Eur.j.Immunol. 6, 511; Kohler et al. (1976). Eur.j.Immunol. 6, 292; Hammerling et al (1981) Monoclonal Antibodies and Т cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.). В частности, моноклональные антитела можно получить по любой технологии, обеспечивающей продуцирование молекул антител с помощью непрерывных клеточных лини в культуре, типа культуры, описанной в работе Kohler et al. (1975) Nature, 256, 495 и в патенте США 4,376,110. Такие антитела могут быть любым иммуноглобулином любого класса, включая IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, или любого их подкласса. Гибридома, продуцируемая моноклональными антителами по настоящему изобретению, может быть культивирована in vivo и in vitro. Способность моноклональных антител продуцировать высокие титры in vivo делает их особенно полезным способом продуцирования.

Кроме того, фрагменты антител могут быть получены по известным методикам. Например, такие фрагменты которые включают фрагменты F(ab’)₂, но ими не ограничиваются, можно получить пепсиновым расщеплением молекулы антитела, а фрагменты Fab могут быть получены восстановлением бисульфидных мостиков фрагментов F(ab’)₂.

Без дальнейшего уточнения предполагается, что на основе приведенного выше описания квалифицированный в данной области человек способен применить настоящее изобретение во всей его полноте. Приведенные далее варианты сделаны просто иллюстративными. Они никаким образом не ограничивают раскрытие настоящего изобретения. Все цитируемые публикации включены в виде ссылок.

Диагностика фиброза печени у вирусинфицированных гепатитом С пациентов на основании уровней uPA, MMP9, β-2MGB и других связанных с фиброзом маркеров в сыворотке крови.

В исследовании принимали участие 140 вирусинфицированных гепатитом С пациентов и 93 здоровых волонтера. И инфицированные пациенты, и здоровые волонтеры были приписаны случайным образом в учебную группу (n=148) и в испытуемую группу (n=85). Все они были подвергнуты обычному лабораторному анализу, включая исследование печеночной панели (GOT/AST,GPT/ALT, общий билирубин, щелочная фосфатаза и альбумин), протромбиновый индекс (INR), AFP, тесты для исключения других видов заболевания печени, УЗИ печени, эндоскопию и модифицированное скинирование.

Проводилась биопсия печени всех пациентов, гистологические характеристики биопсии оценивались по балльной шкале METAVR. Эти образцы (более 10 мм в длину) зафиксировали, покрыли парафином, провели окрашивание гематоксилином и трихромом. Стадию фиброза для каждого образца биопсии оценивали по следующим критериям:

F1: портальный фиброз без септы

F3: многочисленная септа без цирроза, и

Полученная шкала (а именно уровень воспаления, вызванный инфекцией вирусного гепатита С) для каждого образца биопсии определяли также стандартным способом.

(iii) Серологический анализ

У каждого пациента было взято по 10 мл венозной крови, ее поместили в пробирки без добавок, и пробирки сохраняли неподвижными в течение 30 мин. Затем образцы центрифугировали, процесс проводили при 4°С, 1600 g, в течение 15 мин; супернатант был собран.

Концентрацию сывороточного uPA измеряли с помощью набора для иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA), действуя по инструкции производителя. Образцы сыворотки быстро разбавили 1/20 разбавителя, содержащегося в указанном наборе. На пластинки для микротеста, заранее покрытые моноклональным антителом мыши в отношении uPA, поместили 100 мкл стандартного uPA (из набора) или разбавленный образец. Пластинку герметично закрыли, и в течение ночи инкубировали при 4°С, а потом пластинку 4 раза промыли промывочным буфером. Затем на пластинку ввели обработанное биотином антитело в отношении uPA. После инкубирования при комнатной температуре в течение 1 ч пластику промыли и добавили слитую со стрептавидином пероксидазу хрена (HRP). Спустя 1 ч на пластинку добавили раствор, содержащий субстрат HRP, а именно перборат/3,3,5,5-тетраметилбензидин (ТМВ), пластинку выдерживали при комнатной температуре в течение 20 мин для того, чтобы произошла реакция энзимов. Реакцию остановили, введя 50 мкл 0,5 N H₂SO₄; после этого поглощение измеряли при длине волны 450 нм на приборе Spectramax M5 (Molecular Devices). Стандартную калибровочную кривую построили, используя четырехпараметровый подход (SoftMax Pro software, Molecular Devices). Затем на основе полученных величин поглощения по стандартной кривой определили уровень сывороточного uPA. В соответствии с инструкциями производителя все измерения проводились трижды.

Уровень сывороточного ММР9 определяли иммунологическим анализом с помощью Quantikine MMP9 Immunoassay (R&D Systems, Minneapolis, MN). Этот анализ разработан таким образом, чтобы измерять общее количество MMP9, включая 92 кДал форму предшественника, и 82 кДал исходную форму. Разбавленный раствор сыворотки (1:100) помещали на пластинку с микроячейками, предварительно покрытую моноклональным антителом человека в отношении MMP9. Двумя часами позже пластину промыли, и на нее ввели обработанное биотином антитело человека в отношении MMP9. После инкубирования при комнатной температуре в течение 1 ч пластику промыли и добавили слитую со стрептавидином пероксидазу хрена (HRP) а затем перборат/3,3,5,5-тетраметилбензидин (ТМВ). Энзимную реакцию завершили, добавив 1 мол/л сернистой кислоты. Поглощение измеряли при длине волны 450 нм на приборе Spectramax M5 (Molecular Devices). Затем на основе полученных величин поглощения по стандартной кривой определили уровень сывороточного MMP9 так, как это описано выше. Все измерения, в соответствии с инструкциями производителя, проводились трижды. о

Уровень сывороточного β-2MG определяли с помощью энзимного иммунологического анализа следующим образом. 20 мкл образца разбавленной сыворотки (1:100) поместили на микропластинки, заранее покрытые моноклональным антителом мыши в отношении β-2MG и смешали с 200 мкл разбавленного образца. Смесь инкубировали при 37°С в течение 30 мин, затем пластинку 4 раза промыли дистиллированной водой и добавили слитое с пероксидазой хрена (HRP) антитело овцы в отношении β-2MG. После инкубирования при 37°С в течение 30 ч пластинку снова промыли и добавили перборат/3,3,5,5-тетраметилбензидин (ТМВ). Спустя 20 мин реакцию остановили с помощью IN HCl. Поглощение измеряли при длине волны 450 нм на приборе Spectramax M5 (Molecular Devices). Уровень сывороточного B-2MG определяли так, как это описано выше. Все измерения, в соответствии с инструкциями производителя, проводились трижды.

Уровень сыворотки остальных связанных с фиброзом маркеров, а именно GOT, GPT или AFP определяли стандартным способом.

(iv) определение балльных оценок заболевания

Корреляцию между уровнями экспрессии uPA, MMP9, β-2MG или их комбинации и стадиями фиброза определяли с помощью анализа дискриминантных функций, анализа методом гребневых регрессий или анализа логических регрессий, при этом (если это возможно) принимались в расчет клинические факторы. Диагностические величины для каждого из трех биомаркеров или их комбинации оценивали на основе чувствительности, специфичности, прогностичности положительного результата (PPV) и прогностичности отрицательного результата (NPV). Значения чувствительности, специфичности, прогностичности положительного результата и прогностичности отрицательного результата определяли путем испытаний, в которых точки на характеристической кривой обнаружения, соответствующие разным величинам предельной концентрации, обозначают положительный тест.

(i) Характеристика пациентов

Характеристики пациентов, включая клинические факторы, полученные в упомянутых выше тестах, а также уровни сыворотки для биомаркеров, ассоциированных с фиброзом, приведены ниже в таблице 1.

(ii) Связь сывороточных uPA, MMP9 или β-2MG и других клинических факторов с фиброзом печени,

Как показано ниже в таблице 2, сывороточные уровни uPA, MMP9 или β-2MG коррелируют с наличием/отсутствием фиброза у пациентов и его степенью как в учебной группе, так и в испытуемой группе,

Пациенты, у которых фиброз отсутствовал или его степень была низкой, имели низкий уровень uPA и β-2MG, в то время как этот уровень существенно повышался у пациентов со средней или тяжелой стадией фиброза. В частности, было установлено, что в учебной группе средние сывороточные значения uPA в группах F0, F1, F2, F3 и F4 составляли 0,46 нг/мл, 0,61 нг/мл, 0,75 нг/мл, 0,86 нг/мл, и 1,66 нг/мл соответственно, а средние сывороточные значения β-2MG в группах F0, F1, F2, F3 и F4 составляли 1,26 мкг/мл, 1,86 мкг/мл, 2,22 мкг/мл, 2,3 8 мкг/мл и 4 мкг/мл соответственно. С другой стороны, у здоровых пациентов или пациентов с незначительным фиброзом сывороточный уровень ММР9 был существенно выше, чем у пациентов с фиброзом средней или тяжелой степени. Было обнаружено, что средние сывороточные уровни этого маркера составляли 0,33 мкг/мл, 0,16 мкг/мл, 0,19 мкг/мл, 0,14 мкг/мл и 0,1 мкг/мл, соответственно. Очень схожие данные были получены в испытуемой группе. Эти результаты показывают, что маркеры uPA, ММР9 и β-2MG по отдельности являются надежными маркерами при диагностике фиброза печени.

(ii) Двухмаркерная модель для диагностики фиброза печени Результаты этого исследования показывают, что объединение уровней любых двух маркеров из ряда uPA, ММР9, β-2MG, GOT, GPT и AFP с клиническими факторами можно использовать в качестве надежных маркеров для диагностики фиброза печени. Ниже приведены две примерные двухмаркерные модели, а именно uPA+ММР 9 и uPA+GPT, а также уравнения для расчета балльной оценки заболевания на основе объединенных уровней любой пары из двух маркеров. Эти уравнения были разработаны с использованием анализа дискриминантных функций, анализа методом гребневых регрессий или анализа логических регрессий. В приведенных далее таблицах (3-8) указаны предельные концентрации, чувствительность, специфичность, прогностичность положительного результата (PPV) и прогностичность отрицательного результата (NPV), а также площадь под характеристической (ROC) кривой обнаружения (AUROC) для этих двухмаркерных моделей, uPA и MMP9

Анализ дискриминантных функций:

Балльная оценка заболевания = 1,4829×uPa(нг/мл)-3,2605×ММР9(мкг/мл)+5

Значение коэффициента uPA составило от 0,741 до 1,763, предпочтительно от 1,26 до 1,705, а значение коэффициента ММР9 — от -7,553 до -2,839, предпочтительно от -3,75 до -2,771.

Анализ логических регрессий;

Балльная оценка заболевания = exp (Logitvalue)/(1+exp(Logitvalue)), где

Logit_vaiue=-2,2416+3,2059×uPA (нг/мл)-5,6316×ММР9 (мкг/мл)

Коэффициент пересечения составлял от -3 до -1,48, предпочтительно от -2,578 до -1,905, коэффициент для uPA составлял от 2,49 до 3,91, предпочтительно от 2,725 до 3,687, а коэффициент для ММР9 составлял от -8,01 до -3,24, предпочтительно от -6,477 до -4,787.

Анализ методом гребневых регрессий;

Балльная оценка заболевания = 1,6641+1,7227 × uPA (нг/мл) — 1,9821×ММР9 (мкг/мл)

Коэффициент пересечения составлял от 1,430 до 2,531, предпочтительно от 1,414 до 1,914, коэффициент для uPA составлял от 1,191 до 1,938, предпочтительно от 1,464 до 1,895, а коэффициент для ММР9 составлял от -4,428 до -1,501, предпочтительно от -2,279 до-1,685.

Дискриминантный функциональный анализ:

Балльная оценка заболевания = 1,5351×uPA (нг/мл)+0,0083×GPT (IU/L)+5

Значение коэффициента uPA составляло от 0,949 до 1,750, предпочтительно от 1,305 до 1,719, а коэффициент для GPT составлял 0,006 до 0,017, предпочтительно от 0,007 до 0,01.

Анализ логических регрессий:

Балльная оценка заболевания = exp(Logit_value)/(1+exp(Logitvalue)), где Logit_value=-3,7206+3,8376×uPA (нг/мл)+(-0,0001)×GPT (IU/L)

Коэффициент пересечения составлял от -4,30 до -3,14, предпочтительно от -4,279 до -3,274, коэффициент для uPA составлял от 3,11 до 4,57, предпочтительно от 3,262 до 4,413, а коэффициент для GPT составлял от -0,01 до 0,002, предпочтительно от -0,00012 до -0,00008,

Анализ методом гребневых регрессий:

Балльная оценка заболевания = 0,9199+1,8321×uPA (нг/мл)+0,0034×GPT(IU/L)

Коэффициент пересечения составлял от 0,705 до 1,281, предпочтительно от 0,782 до 1,03, коэффициент для uPA составлял от 1,303 до 2,052, предпочтительно от 1,557 до 2,107, а коэффициент для GPT — от 0,002 до 0,009, предпочтительно от 0,0029 до 0,0039.

(iv) Трехмаркерные модели для диагностики фиброза печени.

Ниже для примера описаны трехмаркерные модели, основанные на объединенном уровне трех сывороточных маркеров, выбранных из uPA, ММР9, β-2MG, GOT, GPT и AFP для анализа фиброза печени. При необходимости в расчет принимались также клинические факторы. Эти модели были разработаны с использованием анализа дискриминантных функций, анализа методом гребневых регрессий или анализа логических регрессий. По этим трем моделям были вычислены балльные оценки заболевания, которые анализировались с точки зрения степени его серьезности. Была установлена линейная зависимость между METAVIR стадиями фиброза и балльным оценками.

Четыре предельные концентрации, указывающие (i) некоторый фиброз (Здоровые из F1-F4); (И) умеренный фиброз (Здоровые

F1 из F2-F4); (iii) серьезная степень фиброза (Здоровые

F2 из F3-F4); и (iv) цирроз (Здоровые

F3 из F4) были определены в учебной группе и подтверждены в испытуемой группе.

Дискриминантный функциональный анализ:

Балльная оценка заболевания = 1,4159×uPA (нг/мл)-3,0399×ММР9 (мкг/мл)+0,0897×β-2MG (мкг/мл)+5

Значение коэффициента uPA составлял от 0,389 до 1,604, предпочтительно от 1,204 до 1,586, коэффициент для ММР9 составлял от -7,321 до -2,302, предпочтительно от -3,496 до -2,584, а коэффициент для β-2MG — от 0,048 до 1,114, предпочтительно от 0,076 до 0,103.

Анализ методом логических регрессий:

Балльная оценка заболевания = exp(Logit_value)/(1+exp(Logit_yalue)), где Logit_value=-3,8614+2,8761×uPA (нг/мл)-4,0100×ММР9 (мкг/мл)+0,7853×β-2MG (мкг/мл)

Коэффициент пересечения составлял от -4,9 до -2,28, а коэффициенты для uPA, MMP9, и β-2MG составляли от 2,15 до 3,6, от -6,4 до -1,61 и от 0,47 до 1,1 соответственно, Преимущественно коэффициент пересечения и коэффициенты для uPA, MMP9 и β-2MG составляли от -4,441 до -3,282, от 2,454 до 3,308, от -4,611 до -3,409 и от 0,668 до 0,903 соответственно.

Анализ методом гребневых регрессий:

Балльная оценка заболевания = 1,4645+1,6683×uPA (нг/мл)-1,7868 ×MMP9 (мкг/мл)+0,0926×β-2MG (мкг/мл)

Коэффициент пересечения составлял от 0,558 до 2,418 (например, от 1,245 до 1,684); коэффициенты для uPA, MMP9 и β-2MG составляли от 0,818 до 1,907 (например, от 1,418 to 1,835), от -4,677 до -0,997 (например, от -2,055 до -1,519) и от 0,076 до 0,825 (например, от 0,079 до 0,106) соответственно.

Ниже в таблице 12 приведены результаты, полученные для испытуемой группы для описанной ранее трехмаркерной модели:

На основании приведенных выше результатов были определены диапазоны предполагаемых предельных концентраций для различных стадий заболевания в испытуемой группе (см. таблица 13), при этом принималось во внимание чувствительность, специфичность, прогностичность положительного результата (PPV) и прогностичность отрицательного результата (NPV).

F15,21-5,260,09-0,112,00-2,05F15,26-5,550,11-0,282.05-2,40F1-F25,55-5,630,28-0,352,40-2,50F25,63-6,010,35-0,502,50-2,90F2-F36,01-6,100,50-0,542,90-3,00F36,10-6,620,54-0,753,00-3,80F3-F46,62-6,780,75-0,853,80-3,90F46,78-0,85-1,003,90

Дискриминантный функциональный анализ:

Балльная оценка заболевания = 1,2295×uPA (нг/мл)+(-2,6571)×ММР9 (мкг/мл)+0,0072×GPT(IU/L)+5

Коэффициенты для uPA, MMP9 и GPT составляли от 0,539 до 1,456 (например, от 1,045 до 1,414), от -6,988 до -2,053 (например, от -3,056 до -2,391) и от 0,004 до 0,014 (например, от 0,006 до 0,008) соответственно.

Анализ методом логических регрессий:

Балльная оценка заболевания = exp(Logit-value)/(1+exp(Logit-value)), где Logit-value=-2,1715+3,3171×uPA (нг/мл)+(-6,2008)×ММР9 (мкг/мл)+(-0,0018)×GPT (IU/L)

Коэффициент пересечения составлял от -2,95 до -1,38 (например, от -2,497 до -1,846), а коэффициенты для uPA, MMP9 и GPT составляли от 2,56 до 4,07 (например, от 2,82 до 3,649), от -8,73 до -3,66 (например, от -7,131 до -5,271) и от -0,02 до 0,001 (например, от -0,0021 до -0,0015) соответственно.

Анализ методом гребневых регрессий:

Балльная оценка заболевания = 1,5020+1,6479×uPA (нг/мл)-1,7885×MMP9 (мкг/мл)+0,0028×GPT (IU/L)

Коэффициент пересечения составлял от 1,154 to 2,300 (например, от 1,277 до 1,727), а коэффициенты для uPA, MMP9 и GPT составляли от 1,075 до 1,941 (например, от 1,401 до 1,895), от -4,192 до -1,218 (например, от -2,057 до -1,52) и от 0,001 до 0,007 (например, от 0,0024 до 0,0032) соответственно.

(v) 4-маркерные модели для диагностики фиброза печени. Результаты, полученные в этом исследовании показывают, что комбинация любых четырех факторов из группы uPA, MMP9, β-2MG, GOT, GPT, AFP (причем возможен прием во внимание клинических факторов) представляет собой надежные маркеры для диагностики фиброза печени. Ниже описан примерный вариант маркера, составленного из uPA, MMP9, β-2MG и GPT. Полученные результаты приведены в таблицах 17-19.

Дискриминантный функциональный анализ:

Балльная оценка заболевания = 1,1645×uPA (нг/мл)-2,4312×ММР9 (мкг/мл)+0,0957×β-2MG (мкг/мл)+0,0073×GPT (IU/L)+5

Коэффициенты для uPA, MMP9, β-2MG и GPT составляли от 0,196 до 1,376 (например, от 0,99 до 1,339), от -6,684 до -1,623 (например, от -2,796 до -2,067), от 0,055 до 0,974 (например, от 0,081 до 0,11) и от 0,004 до 0,012 (например, от 0,0062 до 0,0084) соответственно.

Анализ методом логических регрессий:

Балльная оценка заболевания = exp(Logit_value)/(1+exp(Logit_value)), где Logit_value=-3,6742+3,0107×uPA (нг/мл)-4,4549×ММР9 (мкг/мл)+0,7074×β-2MG (мк/мл)+(-0,0017)×GPT(IU/L)

Коэффициент пересечения составлял от -4,74 to -2,61 (например, от -4,225 до -3,123), а коэффициенты для uPA, MMP9, β-2MG и GPT составляли от 2,24 до 3,77 (например, от 2,559 до 3,462), от -6,99 доо -1,92 (например, от -5,123 до -3,787), от 0,39 до 1,02 (например, от 0,6013 до 0,8135) и от -0,004 до 0,001 (например, от -0,002 до -0,001) соответственно.

Анализ методом гребневых регрессий;

Балльная оценка заболевания = 1,2866+1,5874×uPA (нг/мл)—1,5725×ММР9 (мкг/мл)+0,0955×β-2MG (мкг/мл)+0,0029×GPT(IU/L)

Коэффициент пересечения составлял от 0,297 до 2,109 (например, от 1,094 до 1,48), а коэффициенты для uPA, MMP9, β-2MG и GPT составляли от 0,748 до 1,800 (например, от 1,349 до 1,778), от -3,919 до -0,776 (например, от -1,808 до -1,337), от 0,077 до 0,830 (например, от 0,0812 до 0,1098) и от 0,001 до 0,007 (например, от 0,0025 до 0,0033) соответственно.

(vi) 5-маркерные модели для диагностики фиброза печени. Результаты, полученные в этом исследовании показывают, что комбинация любых четырех факторов из группы uPA, MMP9, β-2MG, GOT,

GPT, AFP (причем возможен прием во внимание клинических факторов) представляет собой надежные маркеры для диагностики фиброза печени. Ниже описан примерный вариант 5-маркерной модели, составленной из uPA, ММР9, β-2MG, GPT и GOT. Полученные результаты приведены в таблицах 20-22.

Дискриминантный функциональный анализ:

Балльная оценка заболевания = 1,1009×uPA (нг/мл)-2,2941×ММР9 (нг/мл)+0,0974×β-2MG (мкг/мл)+0,0065×GPT(IU/L)+0,0024×GOT(IU/L)+5

Коэффициенты для uPA, ММР9, β-2MG, GPT и GOT составляли от -0,070 до 1,512 (например, от 0,936 до 1,266), от -6,453 до -1,468 (например, от -2,638 до -1,95), от 0,058 до 1,209 (например, от 0,083 до 0,112), от -0,002 до 0,019 (например, от 0,0055 до 0,0075) и от -0,011 до 0,025 (например, от 0,002 до 0,0028) соответственно.

Анализ методом логических регрессий:

Балльная оценка заболевания = exp(Logit_value)/(1+exp (Logitvalue)),

Logit_value=-3,4751+2,7416×uPA (нг/мл)-4,5237×хММР9 (нг/мл)+0,6952×β-2МО(мкг/мл)-0,0021×GPT(IU/L)+0,0007×GOT(IU/L)

Коэффициент пересечения составлял от -4,54 до -2,4 (например, от -3,996 до -2,954), а коэффициенты для uPA, MMP9, β-2MG, GPT and GOT составляли от 1,87 до 3,61 (например, от 2,33 до 3,153), от -7,13 до -1,9 (например, от -5,202 до -3,845), от 0,38 до 1,01 (например, от 0,5909 до 0,7995), от -0,01 до 0,01 (например, от -0,0024 до -0,0018) и от -0,01 до 0,01 (например, от 0,0006 до 0,0008) соответственно.

Анализ методом гребневых регрессий:

Балльная оценка заболевания = 1,2750+1,3505×uPA (нг/мл)-1,4346×MMP9 (мкг/мл)+0,0978×β-2MG (мкг/мл)+0,0004×GPT(IU/L)+0,0056×GOT(IU/L)

Коэффициент пересечения составлял от 0,145 до 1,909 (например, от 1,084 до 1,466), а коэффициенты для uPA, MMP9, β-2MG, GPT и GOT составляли от 0,576 до 1,826 (например, от 1,148 до 1,553), от -3,676 до -0,603 (например, от -1,65 to -1,219), от 0,077 до 0,862 (например, от 0,0831 до 0,1125), от -0,005 до 0,009 (например, от 0,0003 до 0,0004) и от -0,008 до 0,021 (например, от 0,0047 до 0,0065) соответственно.

(vii) 6-маркерные модели для диагностики фиброза печени Результаты, полученные в этом исследовании показывают, что комбинация uPA, MMP9, β-2MG, GOT, GPT и AFP (причем при необходимости принимаются во внимание клинические факторы) представляет собой надежные маркеры для диагностики фиброза печени. Ниже приведены уравнения для подсчета балльных оценок (разработанные методами дискриминантного анализа, анализа логических регрессий и анализа гребневых регрессий) на основе этих 6-маркерных комбинаций, а также значения предельной концентрации для различных стадий фиброза печени (смотри таблицы 23-25).

Дискриминантный функциональный анализ:

Балльная оценка заболевания=1,4401×uPA (нг/мл)-1,2831×ММР9 (мкг/мл)+0,0921×β-2MG (мкг/мл)-0,0099×AFP(нг/мл)+0,0129×GPT(IU/L)-0,0004×GOT(IU/L)+5

Коэффициенты для uPA, MMP9, β-2MG, AFP, GPT и GOT составляли от 0,141 до 1,923 (например, от 1,224 до 1,656), от -5,052 до -0,393 (например, от -1,476 до -1,091), от 0,069 до 1,303 (например, от 0,078 до 0,106), от -0,032 до 0,054 (например, от -0,0114 до -0,0084), от 0,002 до 0,032 (например, от 0,011 до 0,0148) и от -0,023 до 0,021 (например, от -0,00046 до -0,00034) соответственно.

Анализ методом логических регрессий:

Балльная оценка заболевания = exp (Logit_value)/(1+exp(Logit value)), где Logit_value=-4,1023+2,4436×uPA (нг/мл)-6,8921×MMP9 (мкг/мл)+1,2869×β-2MG (мкг/мл)-0,0112××AFP (нг/мл)-0,0015×GPT(IU/L)+0,0018×GOT(IU/L)

Коэффициент пересечения составлял от -5,6 до -2,61 (например, от -4,718 до -3,487), а коэффициенты для uPA, MMP9, β-2MG, GPT, GOT и AFP составляли от 1,38 до 3,5 (например, от 2,077 до 2,81), от -10,86 до -2,92 (например, от -7,926 до -5,858), от 0,82 до 1,75 (например, от 1,0939 до 1,4799), от -0,01 до 0,01 (например, от -0,0017 до -0,0012), от -0,01 до 0,01 (например, от 0,0015 до 0,002) и от -0,01 до 0,02 (например, от -0,01 до -0,0095) соответственно.

Анализ методом гребневых регрессий:

Балльная оценка заболевания=0,9632+1,4215×uPA (нг/мл)-1,0722×ММР9 (мкг/мл)+0,0986×β-2MG (мкг/мл)-0,0053×АРР(нг/мл)+0,0019×GPT(IU/L)+0,0058×GOT(IU/L)

Коэффициент пересечения составлял от -0,336 до 1,587 (например, от 0,819 до 1,108), а коэффициенты для uPA, MMP9, β-2MG, AFP, GPT и GOT составляли от 0,396 до 2,024 (например, от 1,208 до 1,635), от -2,763 до -0,256 (например, от -1,239 до -0,916), от 0,087 до 1,034 (например, от 0,088 до 0,113), от -0,021 до 0,037 (например, от -0,0061 до -0,0045), от -0,006 до 0,015 (например, от 0,0016 до 0,0021) и от -0,014 до 0,024 (например, от 0,0049 до 0,0066) соответственно.

Все упоминаемые выше модели были подтверждены в испытуемой группе и наблюдались аналогичные результаты, включая предельные концентрации, чувствительность, специфичность, NPV, PPV и AUROC.

Пример 2: Диагностика фиброза печени у пациентов, с положительной реакций на вирус гепатита В, произведенная на основе сывороточных уровней uPA, MMP9 и β-2MG.

В этом исследовании у 30 пациентов-носителей HBV и у 30 здоровых пациентов были также подтверждены маркерные и 3-маркерные модели. Ниже в таблице 26 перечислены полученные данные.

Как показано ниже в таблице 27, сывороточные уровни каждого из uPA, MMP9 и β-2MG коррелируют со степень фиброза:

Ниже в таблицах 28-30 приведены данные по предельной концентрации, представляющей различные стадии фиброза, на основе балльных оценок, которые были вычислены по уравнениям, описанным в 3-маркерной модели примера 1:

Пример 3: Диагностика фиброза печени у пациентов, имеющих алкоголь-зависимый фиброз печени, на основе сывороточных уровней uPA, ММР9 и β-MG.

В этом исследовании принимало участие 53 пациента, имеющих алкоголь-зависимый фиброз печени и 30 здоровых субъектов. Характеристики пациентов приведены ниже в таблице 31. Эти пациенты были подвергнуты обычным лабораторным тестам, описанным выше в примере 1, и специальному опросу для определения их степени потребления алкоголя

Сывороточные уровни uPA, ММР9 и β-2MG у указанных пациентов исследовались твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA), описанным в примере 1. Полученные результаты приведены ниже в таблице 32.

Балльные оценки этих пациентов вычислялись по 3-маркерному уравнению, описанному выше в примере 1; предельные концентрации для различных стадий фиброза приведены ниже в таблице 33.

Все характеристики, раскрытые в этом описании, могут быть объединены в любую комбинацию. Каждый признак, раскрытый в этом описании, может быть заменен альтернативным признаком, имеющим такое же, эквивалентное или аналогичное назначение. Таким образом, если иного не оговорено, каждый признак представляет собой только пример из ряда эквивалентных или аналогичных признаков.

Из приведенного описания каждый квалифицированный в данной области человек способен легко оценить существенные признаки настоящего изобретения. Он может также, не отступая от границ и сущности настоящего изобретения произвести различные изменения и модификации, для адаптации его к различным применениям и условиям. Поэтому другие варианты также включены в формулу изобретения.

1. Способ диагностики фиброза печени у пациента, включающий:
(a) получение образца крови от субъекта, подозреваемого в фиброзе печени;
(b) определение в указанном образце крови уровня (уровней) экспрессии одного или более из ряда: активатор плазминогена урокиназного типа (uРА), матричная металлопротеиназа 9 (ММР9) и β-2-микроглобулин (β-2-MG);
(c) вычисление балльной оценки заболевания, подвергая полученные уровни экспрессии анализу методом дискриминантных функций, методом логических регрессий или методом гребневых регрессий; а также
(d) выявление, имеется ли у указанного пациента фиброз, если бальная оценка выше предварительно определенной предельной бальной оценки, полученной с использованием тех же методов, что и методы, используемые на этапе (с) для определения уровней экспрессии тех же биомаркеров, что и биомаркеры, уровни экспрессии которых определяются на этапе (b) в группах субъектов без фиброза.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанным образцом крови является сыворотка.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанного субъекта выбирают из группы, включающей: носителя вируса гепатита С, носителя вируса гепатита В, пациента, страдающего алкоголь-зависимым заболеванием печени и пациента, страдающего метаболическим заболеванием печени.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная стадия определения осуществляется анализом уровней экспрессии двух из uPA, MMP9 и β-2MG в полученном образце крови.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная стадия определения осуществляется анализом уровней экспрессии uPA, MMP9 и β-2MG в полученном образце крови.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанным образцом крови является сыворотка.

7. Способ по п.5, включающий также в случае установления наличия у указанного субъекта фиброза печени, оценку стадии его фиброза путем сравнения полученной балльной оценки с ранее определенной предельной концентрацией, указывающей определенную стадию фиброза, причем ранее определенная предельная концентрация устанавливается с использованием тех же методов, что и методы, используемые на этапе (с) для определения уровней экспрессии тех же биомаркеров, что и биомаркеры, уровни экспрессии которых определяются на этапе (b), в группах пациентов с определенными стадиями фиброза, и
где у субъектов диагностируется наличие определенной стадии фиброза в случае, если бальная оценка находится в пределах диапазона ранее определенной предельной концентрацией.

8. Способ диагностики фиброза печени у субъекта, включающий:
(a) получение образца крови от субъекта, подозреваемого в фиброзе печени;
(b) определение в указанном образце крови уровней экспрессии (а) одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из активатора плазминогена урокиназного типа (uPA), матричной металлопротеиназы 9 (ММР9) и β-2-микроглобулина (β-2-MG), а также (б) одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из глутаминовой оксалоацетиктрансаминазы (GOT), глутаминовой пировиноградной трансаминазы (GPT) и альфа-фетопротеина (AFP);
(c) вычисление балльной оценки заболевания, подвергая полученные уровни экспрессии анализу методом дискриминантных функций, методом логических регрессий или методом гребневых регрессий; а также
(d) выявление, имеется ли у указанного пациента фиброз, если бальная оценка выше предварительно определенной предельной бальной оценки, полученной с использованием тех же методов, что и методы, используемые на этапе (с) для определения уровней экспрессии тех же биомаркеров, что и биомаркеры, уровни экспрессии которых определяются на этапе (b) в группах субъектов без фиброза.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанным образцом крови является сыворотка.

10. Набор для диагностики фиброза печени, содержащий первое антитело, специфически связанное с активатором плазминогена урокиназного типа (uРА), второе антитело, специфически связанное с матричной металлопротеиназой 9 (ММР9), и третье антитело, специфически связанное с β-2-микроглобулином (β-2-MG).

11. Набор по п.10, содержащий также антитело, специфически связанное с глутаминовой оксалоацетиктрансаминазой (GOT), антитело, специфически связанное с глутаминовой пировиноградной трансаминазой (GPT), и антитело, специфически связанное с альфа-фетопротеином (AFP), или их сочетание.

12. Набор по п.10, отличающийся тем, что указанные антитела представляют собой цельные молекулы иммуноглобулина.

13. Набор для диагностики фиброза печени, состоящий из первого антитела, специфически связанного с активатором плазминогена урокиназного типа (uРА), второго антитела, специфически связанного с матричной металлопротеиназой 9 (ММР9), и третьего антитела, специфически связанного с β-2-микроглобулином (β-2-MG).

14. Набор по п.13, отличающийся тем, что указанный набор содержит также антитело, специфически связанное с глутаминовой оксалоацетиктрансаминазой (GOT), антитело, специфически связанное с глутаминовой пировиноградной трансаминазой (GPT), и антитело, специфически связанное с альфа-фетопротеином (AFP), или их сочетание.

15. Набор для диагностики фиброза печени, содержащий (а) антитело, специфически связанное с активатором плазминогена урокиназного типа (uРА), антитело, специфически связанное с матричной металлопротеиназой 9 (ММР9), и антитело, специфически связанное с β-2-микроглобулином (β-2-MG), или их сочетание; а также (б) антитело, специфически связанное с глутаминовой оксалоацетиктрансаминазой (GOT), антитело, специфически связанное с глутаминовой пировиноградной трансаминазой (GPT), и антитело, специфически связанное с альфа-фетопротеином (AFP), или их сочетание.

16. Набор по п.15, отличающийся тем, что указанные антитела представляют собой цельные молекулы иммуноглобулина.

17. Набор для диагностики фиброза печени, состоящий из (а) антитела, специфически связанного с активатором плазминогена урокиназного типа (uРА), антитела, специфически связанного с матричной металлопротеиназой 9 (ММР9), антитела, специфически связанного с β-2-микроглобулином (β-2-MG), или их сочетания; а также (б) антитела, специфически связанного с глутаминовой оксалоацетиктрансаминазой (GOT), антитела, специфически связанного с глутаминовой пировиноградной трансаминазой (GPT), и антитела, специфически связанного с альфа-фетопротеином (AFP), или их сочетания.

источник